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HPCE高效毛细管电泳的基本原理分享

2019-07-08作者:浏览次数:51
高效毛细管电泳(high performance capillaryelectrophoresis,HPCE)是近年来开展起来的一种别离、剖析技术,它是凝胶电泳技术的开展,是高效液相色谱剖析的补充。该技术可剖析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。可用于剖析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等,HPLC剖析高效、快速、微量。

电泳迁移
不同分子所带电荷性质、几不同,外形、大小各异。一定电解质及PH的缓冲液或其它溶液内,受电场作用,样本中各组分按一定速度迁移,从而构成电泳。
电泳迁移速度(v)可用下式表示:
v=uE
其中E为电场强度(E=V/L,V为电压,L为毛细管总长度)。u为电泳淌度。

电渗迁移
电渗迁移指在电场作用下溶液相关于带电管壁挪动的现象。特殊构造的熔合硅毛细管管壁通常在水溶液中带负电荷,在电压作用下溶液整体向负极挪动,构成电渗流。带电微粒在毛细管内实践挪动的速度为电泳流和电渗流的矢量和。

别离剖析类型
依据其别离样本的原理设计不同主要分为以下几品种型:
①毛细管区带电泳(capillary zoneelectrophoresis,CZE);
②毛细管等速电泳(capillarychromatography,CITP);
③毛细管胶速电动色谱(miceller electrokineticcapillary chromatography,MECC);
④毛细管凝胶电泳(capillarygelelectrophoresis,CGE);
⑤毛细管等电聚焦(capillary isoelectricfocusing ,CIEF)。

毛细管区带电泳(CZE)为HPCE的根本操作形式,普通采用磷酸盐或硼酸盐缓冲液,实验条件包括缓冲液浓度、pH值、电压、温度、改性剂(乙腈、甲醇等),用于对带电物质(药物、蛋白质、肽类等)别离剖析,关于中性物质无法完成别离。毛细管胶束电动色谱(MECC)为一种基于胶束增溶和电动迁移的新型液体色谱,在缓冲液中参加离子型外表活性剂作为胶束剂,应用溶质分子在水相和胶束相分配的差别停止别离,拓宽了CZE的应用范围,合适于中性物质的别离,亦可区别手性化合物,可用于氨基酸、肽类、小分子物质、手性物质、药物样品及体液样品的剖析。毛细管等速电泳(CITP)采用先导电解质和后继电解质,构成不连续缓冲体系,基于溶质的电泳淌度差别停止别离,常用于离子型物质(如有机酸),并因适用较大内径的毛细管而可用于微制备,但本法空间分辨率较差。毛细管等电聚焦电泳(CIEF)用于具兼性离子的样品(蛋白质、肽类),等电点仅差0.001可别离的物质。毛细管凝胶电泳(CGE)根据大分子物质的分子量大小停止别离,主要用于蛋白质、核苷酸片段的别离。此外,还有毛细管电色谱(CEC)及非水毛细管电泳(CNACE),用于水溶性差的物质和水中难停止反响的剖析研讨。目前CZE和MECC用得较多,本文以这两种办法为例来阐明HPLC的原理。

CZE的根本原理
HPLC选用的毛细管普通内径约为50μm(20~200μm),外径为375μm,有效长度为50cm(7~100cm)。毛细管两端分别浸入两分开的缓冲液中,同时两缓冲液中分别插入连有高压电源的电极,该电压使得剖析样品沿毛细管迁移,当别离样品经过检测器时,可对样品停止剖析处置。HPLC进样普通采用电动力学进样(低电压)或流膂力学进样(压力或抽吸)两种方式。在毛细管电泳系统中,带电溶质在电场作用下发作定向迁移,其表观迁移速度是溶质迁移速度与溶液电渗流速度的矢量和。所谓电渗是指在高电压作用下,双电层中的水合阴离子惹起流体整体地朝负极方向挪动的现象;电泳是指在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象。溶质的迁移速度由其所带电荷数和分子量大小决议,另外还受缓冲液的组成、性质、pH值等多种要素影响。带正电荷的组份沿毛细管壁构成有机双层向负极挪动,带负电荷的组分被分配至毛细管近中区域,在电场作用下向正极挪动。与此同时,缓冲液的电渗流向负极挪动,其作用超越电泳,最终招致带正电荷、中性电荷、负电荷的组份依次经过检测器。

MECC的根本原理
MECC是在CZE根底上运用外表活性剂来充任胶束相,以胶束增溶作为分配原理,溶质在水相、胶束相中的分配系数不同,在电场作用下,毛细管中溶液的电渗流和胶束的电泳,使胶束和水相有不同的迁移速度,同时待别离物质在水相和胶束相中被屡次分配,在电渗流和这种分配过程的双重作用下得以别离。MECC是电泳技术与色谱法的分离,合适同时别离剖析中性和带电的样品分子。
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