技术中心
technology
CENTER

工程师学习篇共聚焦显微镜的使用和管理

2021-05-17作者:浏览次数:455

在生命科学研发中, 共聚焦显微技术已经成为生物医学中一个标准的研究工具。目前共聚焦显微镜的功能非常多,好像是一个科研工作站,其应用也大多在生命科学研究领域。围作为大型贵重精密仪器,LSCM的日常使用的管理需要按照严格的规程来实施,LEICATCSSP5共聚焦显微镜的使用及管理方法如下。

共聚焦显微镜细胞爬片制备流程:载玻片,盖玻片一定要选择质量好,光洁,无杂质的。重要实验,需要提前检查载玻片,盖玻片的光学特性,确保无荧光干扰。盖玻片的厚度应小于O.17ram,使用前需要用玻璃洗液浸泡处理一天以上,铬酸浸泡过夜,去离子水冲洗掉残存的洗液后,无水乙醇中浸泡待用。临用前在酒精灯上过火灭菌处理后,放置在细胞培养皿中。

一、共聚焦显微镜仪器的组成

人员必须经过培训,了解仪器组成,工作原理和操作规范方可上机。

1、仪器的组成

LEICATCSSP5主要由四部分组成:(1)显微镜光学系统。为倒置显微镜;镜头包括共聚焦专用平场复消色差10X20×,40X 63(油镜),100X(油镜)镜头;(2)扫描装置;(3)激光光源。本机器包含4个激光器:405nm激光,氩离子激光(457476488514nm), 56lnm激光,氦氖633nm激光,共四个检测通道;(4)检测系统。整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活进行。由于激光器在工作时散发大量的热,需要风扇降温,突然断电可能烧坏激光器,因此还需要配备稳压电源和不间断供电装备。

2、工作原理

LSCM的工作原理是:照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,激光光源经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一点进行扫描。然后,激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集,并将信号输送到计算机,在这光路中,焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的,不能通过小孔,只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔被观测到。

二、共聚焦显微镜操作基本步骤

1)打开稳压电源。

2)依次打开电脑桌右侧电脑显微镜,扫描器,激光电源开关,将激光开关钥匙顺时针旋转9O。至"Onl"位置。(各按钮间隔时间15s以上)。

3)打开显微镜电源及荧光电源。

4)启动徕卡共聚焦软件"LASAF"

5)选择合适的物镜,视野。

6"TL/IL"功能键在明视场和荧光之间切换,通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块,进行样品的荧光观察。

7)工具栏下方Configuration>Laser,根据染料的激发波长,选择所需激光。

8)点击"Aquire"进行光路设置,可改变所选激光,调节激光输出功率,改变分光镜,改变所选PMT,调节PMT检测范围,调节PMTgainoffset

9)单击"AdditionalChannels"以显示透射光检测器("PMTTrans"),选择观察方法(BFDIC等)。

10)在"Acquire"菜单栏的"Acquisition" 中选择扫描模式("AcquisitionMode"),默认模式为xyz扫描,是最常用的扫描模式,可用于xy扫描和z轴层切(xyz扫描)。还可按样品扫描需要在下拉菜单中选择由XYzt(时间)以及(波长)组合而成的多维扫描模式,~Nxzyxytxyxyztxyz入,xyzt等。

11)在"Acquire"菜单栏的"Acquisition"中设置扫描参数,包括分辨率,扫描速度,针孔大小,线平均,面平均,累加及放大倍数等。

12)预览图像并优化参数。点击"Live"以设定的扫描参数预览图像,图像将显示在右侧的显示屏上。调节Z轴位置找到最适合观察的焦平面,并调节PMT的电压及偏移,或激光输出功率使图像达到最佳。可通过控制面板上相应旋钮调节以上参数。需注意参数对图像质量的正面和负面影响。

13)采集图像并保存。单击"Capture Image"采集图像,注意:从获取第一张图片后就要开始保存,以后每获取一张图片都要保存一次,以免数据丢失。

14)关闭显微镜汞灯电源。若使用过油镜,需用清洁液或无水乙醇清洁镜头。

15)关闭LASAF软件,将激光开关钥匙逆时针旋转9O。至"On-0"位置,依次关闭扫描器电源,电脑,显微镜电源。

16)风扇停止后(关闭激光开关钥匙约15min后),关闭激光电源按钮。记录关机时间,仪器状况等信息。

征稿、访谈、专题合作邮件:
tougao@instrumentsinfo.com
版权与免责声明:
凡本网注明“来源:仪器设备网”的所有作品,版权均属于山东新路领航信息技术有限公司-中国仪器设备网合法拥有版权或有权使用的作品,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。 已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:中国仪器设备网,http://www.instrumentsinfo.com”,违反上述声明者,本网将追究相关法律责任。 本网转载并注明自其它来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,我们将及时作出删除或修改,否则视为放弃相关权利。
转载本站原创文章请注明来源:仪器设备网
推荐展会
2021综合能源服务产业暨电力用户侧技术发展高峰论坛
时间:2021年06月17日-18日
主办:
地点:
2021第10届华中科学仪器与实验室装备展览会
时间:2021年10月14日-16日
主办:武汉东湖国家自主创新示范区生物医药行业协会
地点:
2021国际检验医学精准诊疗大会暨2021国际检验医学暨体外诊断试剂展览会
时间:2021年12月25日-27日
主办:中国肿瘤防治联盟
地点: 广州市科丰路89号萝岗万达广场写字楼B1栋2304室
扫码登陆 仪器设备网手机版
微信公众号