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HEP3B 人肝癌细胞的处理方法与应用!

2021-05-14作者:百欧博伟浏览次数:661  来源:北京百欧博伟生物技术有限公司

HEP3B 人肝癌细胞的处理方法与应用!



一、背景


HEP3B人肝癌细胞系于1979年,源自一位患有肝癌的7岁黑人男童。该细胞产生甲胎蛋白(alpha-fetoprotein)、乙肝表面抗原(BHsAg)、白蛋白、巨球蛋白、α-抗胰蛋白酶(alphal-antitrypsin)、转铁蛋白、补体(C3)、C3活性载体,纤维原等,具有广泛的研究价值。


二、培养基及培养冻存条件准备:


1)准备基础培养基(GIBCO,,添加NaHCO3 1.5g/L,丙酮酸钠0.11g/L);优质胎牛血清,10%。


2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。


3)冻存液:90%完全培养基,10%DMSO,现用现配。液氮储存。


三、细胞处理:


1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。


2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。


3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时,弃去培养基后加入少量胰酶,细胞变圆脱落后,加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中,再添加10%DMSO后进行冻存。


对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:


1、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。


2、加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。


3、按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。


4、将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。


四、应用


用于LI-cadherin对人肝癌细胞Hep3B生长的影响及其机制研究:


应用siRNA干扰技术下调人肝细胞肝癌细胞株Hep3B中肝肠钙粘连蛋白(LI-cadherin,CDHl7)的表达,研究LI-cadherin对人肝癌细胞生长的影响,并初步探讨其机制。


方法:


1、按Lipofectamine脂质体转染法,将si RNA转染入Hep3B中,使用(G418液筛选稳定转染的Hep3B-LI-cadherin-SiRNA细胞株,并利用荧光倒置显微镜观察其转染效率。


2、用Western Bloting(蛋白质印迹)方法检测各组细胞中Ll-cadherin蛋白及细胞周期相关蛋白CyclinDl表达量变化情况。


3、用MTT(四唑盐比色法)法检测LIcadherin对肝癌细胞生长的作用并绘制细胞生长曲线;4运用Pl/Rnase染色-流式细胞分析法检测各组细胞周期分布;


结果:1利用倒置荧光显微镜观察,发现SiRNA转染组细胞中大部分可见明显的绿色荧光,证实已成功转染。并且通过计算得出视野内发出荧光的细胞占全部细胞的85%,即转染效率为85%,符合本实验的基本条件。


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