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各种接种技术和细菌生长状况的观察!

2021-03-03作者:百欧博伟浏览次数:266  来源:北京百欧博伟生物技术有限公司

各种接种技术和细菌生长状况的观察!


1、学会正确使用微生物学实验室中常用的接种工具,掌握各种接种技术。


2、掌握无菌操作技术和获得微生物纯培养物的方法。

3、学会判断细菌在不同培养基上的生长状况。


一、常用接种工具


1、接种环

接种环是用金属丝做成的。使用前后均应在火焰上彻底灼烧灭菌,灭菌时右手持接种环(或接种针)之木柄,将铂丝直立于火焰中,渐渐下移使铂丝烧红,并将铂丝和木柄之间的金属捧也通过火焰数次。取菌时,必须待接种环(针)冷却后方可使用。


2、接种针

灭菌处理基本上同接种环。


3、吸管

微生物学实验一般使用刻度到底的吸管,须进行无菌操作时,事先塞少许棉花于吸管上端管口内,然后把吸管置于金属筒中或用纸条缠包起来,干热灭菌后方可使用。


4、微量移液器

可调微量移液器外形如图实验-7所示,主要部件有按钮、弹簧、活塞和可装卸的滴头(tip)。按动按钮,使弹簧上下活动,可在10~1000μl之间定量吸放液体。滴头可一次性使用,方便省事。


二、各种培养基的接种方法


培养物往新的培养基上移植,叫做接种。根据目的不同可分别采用接种环、接种针、移液管等进行斜面接种、液体接种、半固体穿刺接种和琼脂平板划线分离等。


“无菌”是保证微生物实验室工作成功的前提条件,要做到这一点就得使用无菌的材料、器皿和采用无菌操作技术。无菌操作技术主要是防止外界环境微生物污染实验材料、破坏实验微生物的纯培养状态,同时也要防止实验材料污染环境或感染人体。因而要求:① 工作环境需用消毒液处理; ② 接种工具必须严格无菌。


1、实验材料

1)菌种

金黄色葡萄球菌斜面培养物,大肠埃希菌斜面培养物和液体培养物,枯草杆菌斜面培养物,藤黄八叠球菌斜面培养物,链球菌培养物,混合的细菌菌种(金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌)。

2)接种工具

接种环,接种针,无菌吸管,酒精灯。

3)培养基及其它

琼脂斜面培养基,试管肉汤培养基,半固体培养基,琼脂平板培养基,琼脂高层培养基,无菌平皿等。


2、实验方法

1)斜面培养基接种法

a、左手持菌种管与培养基管,斜面皆向上,菌种管在外侧,右手如拿毛笔的姿势持接种环,将铂丝与欲进入试管的柄部通过火焰灭菌。

b、右手的小指与掌心夹下培养基管棉塞,第四指与小指夹下菌种管棉塞,管口通过火焰。

c、接种环伸入菌种管,沾取少许菌种。

d、接种环伸入培养基管,在斜面上蜿蜒划线。注意沾有菌种的接种环不可碰管口与其它地方。

e、管口再通过火焰,并将棉塞塞于原来的试管。

f、接种环再灭菌。

2)液体培养基接种法

基本上与斜面培养基接种法相同,不同之处是,将挑取的菌种移种至液体培养基管中时,斜持试管,将菌涂于液面处管壁上,试管直立以后菌种即在液体内。

用接种环分别挑取金黄色葡萄球菌斜面培养物、枯草杆菌斜面培养物、大肠埃希菌培养物,接种于肉汤培养基中,每菌接种1支。将已经接种好试验菌的各管置于37℃恒温箱培养24~48h。观察上述各菌在液体培养基中的生长状况。

3)半固体培养基接种法

半固体培养基接种时应用接种针,接种针使用方法基本同接种环。接种时,将沾取菌种的接种针从半固体培养基表面向下穿刺,但不触及管底,接种针循原路抽出。此称为“穿刺接种法。

分别接种金黄色葡萄球菌、枯草杆菌至半固体培养基中,放入37℃恒温箱中培养24h后观察它们的生长状况,判断它们是否具有动力。

4)琼脂平板划线分离法

平板划线有多种方法,其目的都是要将细菌分开,培养后可观察单个菌落的特征。若挑取单个菌落移种至另外的培养基中,培养后即得纯培养物。现介绍常用的平行划线法及分区划线法。

①平行划线法

将接种环灭菌后,从菌种管沾取少许菌种,涂于平板培养基表面一端的边缘处,再将接种环灭菌,以杀死过多的细菌。从涂有细菌处开始做往返平行划线,若从液体培养物取菌或从斜面培养物取少量菌,估计分离出单个菌落时,取菌后可直接从平板一端向下划平行线,可不必再将接种环灭菌。

分别取大肠埃希菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌的少许菌苔,在不同的无菌平板上通过分区划线或平行划线进行划线分离。划线后的平板在37℃恒温箱中倒置培养24~48h。取出平板,从以下几个方面来观察不同细菌的菌落:

大小:以毫米计。

形状:圆形、不规则形、放射状等。

表面:光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。

边缘:整齐、波形、锯齿状等。

色素:有无色素、颜色,是否可溶(可溶色素使培养基着色)等。

透明度:透明、半透明、不透明。

②分区划线法

如图实验-11所示,用接种环将所取菌种先划线于a处。将接种环灭菌,从a处将菌划出至b处。接种环再次灭菌后,从b处划出至c处,依次类推,以达到培养后能获得单个菌落的目的。

5)倾注平板法

本法常用于细菌总数、细菌对药物的敏感度试验以及药物的含量测定等。倾注平板的常用的操作方法有两种:

a、液混入培养基法

用无菌吸管吸取定量菌液,加入已熔化并冷却至约50℃的琼脂培养基中,迅速混匀,倒入无菌平皿,使均匀布满皿底。平置勿动,凝固后即成含菌平板。此法细菌分布均匀,药物的抑菌试验(药敏试验)多用此法制备含菌平板。

b、菌液先加入平皿法

以无菌吸管吸取定量菌液或其它含菌样品,加入无菌平皿中,再将熔化并冷至约50℃的无菌琼脂培养基倾入该平皿中,立即将平皿轻轻地作旋转晃动,以使菌液与培养基混合均匀,平置待凝固。计算药品、食品等样品中细菌总数时常用此法。因为是将定量样品直接加入平皿中,所以菌数较准确。


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