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培养基的制备、融化程序的确认及注意事项!

2021-02-25作者:百欧博伟浏览次数:131  来源:北京百欧博伟生物技术有限公司

培养基的制备、融化程序的确认及注意事项!


一、培养基的制备


微生物实验室所用培养基可按药典规定检查方法中所列的培养基配方配制,也可使用复合型的干燥培养基,或是使用已配制且分装好的成品培养基。干燥培养基是将新鲜配制的液体培养基用不同的方法使水分去掉;或将培养基内的各种固形成分,经过适当的处理,充分混匀,使成干燥的粉末状。用时只要按比例加入一定量的蒸馏水,经过溶解、分装、高压蒸汽灭菌,即可应用。其优点是节省培养基配制时间,携带方便,使用简易,特别使用于一般流动性及设备简单的小型实验室。目前,国内外已有多家生产,如法国生物梅里埃公司、美国密理博公司的产品、中国药品生物制品所监制的产品,其制造方法有下列几种:喷雾法、真空法、烘干法、蒸发法、球磨法。


药品微生物限度检验、无菌检验、抗生素效价测定、药敏试验及其抗菌、防腐等项微生物检测中,培养基的质量好坏、稳定与否,对检验结果有极为重要的影响。但因培养基的配方中各原料成分的理化性能、稳定性不同,致使检验结果有较大差异,即使同一厂家生产的同一型号的原料产品,各个批号之间质量都有较大的差异,加上各地实验室配制培养基的方法不一,同一实验生长有显著不同。为此培养基的质量标准十分重要。干燥培养基,使用方便,节约人力、物力、时间,是培养基标准化的必由之路。按说明书要求称取适量后加水溶解配制,所用培养基质量必须符合药典规定的灵敏度检查试验及无菌性检查试验才可用于检验。


配制培养基、缓冲液、试剂等时,称量要迅速以免吸潮而影响称量的准确性,同时为避免增加培养基等中的金属离子及其他微量化学元素而影响微生物的生长、鉴别、所用器具、容器应为洁净玻璃制品,所用溶解用水应为纯水或蒸馏水。加热溶解时不断搅拌促进培养基充分溶解,采用直火加热时易使培养基结底炭化而影响营养度和澄明度,可用沸水浴或隔套蒸锅通过蒸汽加热。然后调节pH,按规定的要求分装,容器封口后用经验证过的灭菌程序灭菌。灭菌程序的参数应记录于高压灭菌柜的使用日志及相应的配制记录中。注意灭菌后物品应有适当措施防止再次污染。制备某些选择性培养基或淋洗液需在使用前向培养基中加入β-内酰胺酶等试剂时,务必确保所加入剂的无菌性和质量保证。


制备好的培养基、缓冲液等应及时抽取适量用于检查pH、无菌性、灵敏度等质量是否符合规定。微生物检验用培养基、缓冲液及试剂的配制应有原始记录供追溯检查。所有相关信息包括:名称、处方原材料、称量数、稀释溶解量、灭菌条件、灭菌程序参数,制备日期、制备人签名、质量检查结果等,都必须在原始记录或工作日志上反映出来。


二、培养基融化程序的确认


装于试管瓶内的成品固体培养基,在使用前需将其融化。这一融化过程也同样需要确认,以保证培养基的营养成分不会因过度加热而受影响。


一般培养基应只能进行1次蒸汽灭菌处理,否则,重复高温加热会破坏培养基的营养成分。因此,不宜使用蒸汽灭菌柜融化琼脂培养基,宜选用沸水浴或微波炉融化培养基。因沸水浴的温度始终控制在100℃以内,相当安全,但对装量较大的培养基要使融化均匀充分,则加热的时间较长,微波炉融化培养基具有快速的优点。


至少选择3批具有代表性的不同类型培养基,对其融化前后的质量进行对比检查。确认时,应对不同融化法的运行参数(时间和温度)予以明确设定,确认合格后,将其写入相应的标准操作规程中。如果一台设备可以设定多个参数,建议在其最高和最低设定值下分别进行确认试验,以确定正常的使用范围。有关抗生素效价分析用培养基的融化过程确认方法,要参照有效期的确认试验方法进行。


三、培养基制备应注意事项


1、常用玻璃仪器的准备

制备培养基所用的吸管、锥形瓶、毛细吸管、平皿等玻璃仪器用前要用肥皂水洗刷后用清水冲洗干净,晾干后备用。

1)平皿用纸或布包好,或装在金属盒内,于121℃高压蒸汽菌3min后烘干,备用。

2)试管管口用棉花塞或硅氟塑料试管塞塞好,再用布或报纸包扎好,121℃高压蒸汽灭菌20℃后烘干,备用。

3)吸管及滴管先用少许棉花塞于吸口端(防止污染物吸出,或橡皮帽内的气体污染),然后用纸包后或装入金属吸管筒内,于121℃高压蒸汽灭菌20min后烘干,备用。其他玻璃器皿均应按上法处理,也应装金属筒内160℃干热灭菌2h后,备用。


2、培养基的制备及储存

1)溶化:一般应放在玻璃器皿或搪瓷齐内。加入蒸馏水,隔水加热以促其溶解,加热时应经常搅拌,防止焦结,待其溶解后补足水分。

在使用干燥培养基时,先将蒸馏水按定量加入容器中,然后称取一定量培养基干粉放入水中,静置10—15min,搅拌,振荡,或延长时间以促进溶解,一般不要热,必要时加热,但时间不宜过长,温度不宜过高,避免某些营养成分被破坏。

2)校正酸碱度(调节pH):培养基必须有适当的pH。因此测定pH是培养基配制过程中的重要步骤之一,测定pH的标准温度为25士2℃。调节pH可用无菌的1mol/l氢氧化钠溶液或10%碳酸钠溶液、1mol/l盐酸溶液。当调节缓冲液的pH时,宜用6mol/l磷酸或10mol/l氢氧化钾溶液。灭菌后的pH会比灭菌前的pH升高或降低,一般高压灭菌前培养基的pH会比最终pH调高0.2左右,灭菌后基本合适。因此对培养基、缓冲液、试剂在灭菌前后的pH均进行测定,并记下每次pH的测定结果,有助于积累数据考察每种培养基、缓冲液、试剂对灭菌程序的耐受性,从而指导灭菌前pH的调节。干燥培养基一般已校正过pH,用时也必须再验证。测定时,一般用指示剂滴入培养基观察其颜色的变化,或用pH计校正,如与所需pH不符,可用以上的酸或碱液加以校正。调整pH后要加热过滤,使培养基澄清。

3)培养基的分装:大批量配制时使用的自动分配器须经校准和确认。每次使用前后,均要对分配器的管道系统进行冲洗,在分装无菌培养基前,则要采用无菌硅胶管。

固体培养基一般分装在250ml、500ml锥形瓶中,高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。

平皿:倾注平皿,应在无菌室中放置3—4h,如用塑料平皿须在35℃培养箱 中倒置30—60min。让水蒸汽自然蒸发。

斜面:制备低层斜面分装于试管,约占容积1/5,灭菌后趁热斜放在细玻璃棒和木杆上,使成斜度,分装使注意管口和瓶塞上勿沾有培养基,如沾有培养基应用布抹去,以避免污染。

高层斜面:制备高层斜面分装于试管,约占试管容积的1/3,灭菌后趁热放置成高层短斜面,待其凝固后应用。

分装好的培养基或缓冲液等及时密封后必须在配制当天(2h内最佳)进行灭菌处理。液体、半固体培养基一般在高压灭前分装,约装试管容积的1/3,在灭菌后还要加其他成分的液体、半固体培养基,灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。

培养基的灭菌:培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌,各种培养基的灭菌时间和压力,按其成分不同而定。普通培养基采用121℃、103.42kPa灭菌15min,但容器和装量较大时,应延长至20min。含糖培养基115℃、68.85kPa灭菌30min。含糖、血清、鸡蛋等培养基可用流动蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min,连续3d,间歇灭菌。血清或组织液,采用低热56—58水浴1h,连续5—6d灭菌,一些遇高温即被破坏的物质如尿素、腹水等,可用细菌过滤器,过滤除菌。高压灭菌应严格按照操作规程执行,必须逐渐加热,彻底排除灭菌器内的空气,再逐渐升压保持预定的压力和时间,达到全部杀灭微生物。以上的灭菌时间和温度要经过验证确认,如不同类型培养基混合一起灭菌时宜采用115℃、68.85kPa灭菌30min为好。


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