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组织细胞RNA提取试剂盒的应用与操作步骤!

2021-02-24作者:百欧博伟浏览次数:94  来源:北京百欧博伟生物技术有限公司

组织细胞RNA提取试剂盒的应用与操作步骤!


一、概述


试剂盒是一种将测定一种成分所需要的2种或2种以上的试剂及实验室一般用品连同操作说明书包装在一起,形成商品化的试剂单位,即由厂家提供给用户使用的一种套装试剂,使用者除用自备的蒸馏水或试剂盒提供的缓冲液进行复溶试剂的操作外不需要作任何试剂配制。目前检测试剂已广泛采用这一方式提供,试剂盒的应用不但节约人力减少配制误差,而且有利于试剂质量的保证和实验室间方法学的统一,提高了可比性。


组织细胞RNA提取试剂盒可独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,后低盐的RNasefreeH20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。


二、应用


组织细胞RNA提取试剂盒将高效的异硫氰酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合,可从动物细胞及组织中高效提取总RNA。起始样本一般*多30mg组织或1x107细胞。组织细胞RNA提取试剂盒还可回收未完全纯化的RNA、体外转录和酶促反应后得到的RNA。用组织细胞RNA提取试剂盒可提取纯化分子量大于200碱基的高品质RNA,几乎无DNA残留。如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验,残留的DNA可利用无RNase的DNaseI在柱上进行消化去除。提取的RNA可用于RT-PCR、NothernBlot、DotBlot等下游实验。


三、操作步骤


使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%,如1mlRLT中加入10μlβ-巯基乙醇。此裂解液建议现用现配。配好的RLT4℃可放置一个月。


1、组织培养细胞

a.收集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管,对于贴壁细胞,孔板培养可以直接裂解,细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。

b.2,000rpm离心10sec(或者300g离心5min),使细胞沉淀下来。完全吸弃上清,留下细胞团,注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。

c.轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬,加入350μl(<5x106细胞)或者600μl(5x106-1x107细胞)裂解液RLT,吹打混匀后用手剧烈振荡20sec,充分裂解。

d.用带钝针头的一次性1ml(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物5-10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30sec),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。


2、动物组织(例如鼠肝脑)

a.电动匀浆:新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入350μl(<20mg组织)或者600μl(20-30mg组织)的裂解液RLT后电动彻底匀浆20-40sec。

b.液氮研磨+匀浆:在液氮中研磨组织成细粉后,取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μl/600μl组织裂解液RLT的1.5ml离心管中,用手剧烈振荡20sec,充分裂解。用带钝针头的一次性1ml(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30sec),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。

c.将匀浆后裂解物12,000rpm离心3min,沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物,将裂解物上清小心转到一个新离心管。


3、较估计裂解物(上清)体积,加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。


4、立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心60sec,弃掉废液。


5、加350μl去蛋白液RW1,室温放置30sec,12,000rpm离心30sec,弃掉废液。将吸附柱RA放回收集管中。


6、DNaseI工作液的配制:取10μlDNaseI储存液放入新的RNase-free离心管中,加入70μlRDD溶液,轻柔混匀。


7、向吸附柱RA中央加入80μlDNaseI工作液,室温放置15min(一般情况下室温放置可得到较好的消化效果,如果室温效果不佳可选择在37℃放置15min)。


8、加350μl去蛋白液RW1,室温放置30sec,12,000rpm离心30sec,弃掉废液。将吸附柱RA放回收集管中。


9、加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30sec,弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。


10、将吸附柱RA放回空收集管中,12,000rpm离心2min,将吸附柱置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。


11、取出吸附柱RA,放入一个RNasefree离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μlRNasefreewate(r事先在65℃水浴中加热效果更好),室温放置1min,12,000rpm离心1min。


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