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揭示anti-CRISPR沉默CRISPR-Cas9系统的分子机理
2019-07-09作者:浏览次数:21

中国科学院生物物理研讨所王艳丽课题组和加拿大多伦多大学Karen Maxwell课题组的协作论文Inhibition of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complex assembly by anti-CRISPR AcrIIC2 在《自然-通讯》(Nature Communications)杂志在线发表。

该工作报道了2.45埃的apo AcrIIC2和2.28埃的分离了Neisseria meningitides Cas9 (Nme1Cas9) BH domain的AcrIIC2复合物晶体构造,分离体内和体外实验,系统论述了anti-CRISPR蛋白AcrIIC2缄默CRISPR-Cas9系统的分子机理。王艳丽课题组不断努力于CRISPR-Cas系统抗病毒作用机理的研讨,前期研讨提醒了一系列重要的CRISPR-Cas系统的作用机理(Nature 2014, Cell 2015, Cell Res. 2016, Cell 2017a, Cell 2017b, Mol. Cell 2017, Cell 2018, Mol. Cell 2019, Cell 2019)。

CRISPR/Cas系统是普遍存在于细菌和古菌中的抵御病毒和外源质粒入侵的取得性免疫防御系统。CRISPR-Cas系统分为两大类。

第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物(如Cascade,Csm complex等)发挥功用;第二大类是由单个效应蛋白(如Cas9, Cas12,Cas13等)来发挥功用。Cas9具有RNA介导的DNA内切酶和RNA内切酶活性。由于能够特异性辨认、分离、切割DNA,且具有可编程性,Cas9被普遍运用于基因编辑和基因表达调控范畴。2017年,Karen Maxwell课题组报道了3个来自于致病菌Neisseria meningitides 的anti-CRISPR蛋白,并命名为AcrIIC1,AcrIIC2,AcrIIC3。这是初次发现的能够抑止CRISPR-Cas9系统的anti-CRISPR蛋白。构造和功用研讨标明,AcrIIC1经过和Cas9的HNH 构造域催化中心分离,抑止Cas9的基因编辑活性。

该研讨中,研讨人员经过生化实验发现AcrIIC2和Nme1Cas9分离后,能够抑止sgRNA(由crRNA和tracrRNA交融而成)的分离,从而使Nme1Cas9的功用被抑止。研讨人员随后解析了2.45埃的apo状态AcrIIC2晶体构造。构造发现AcrIIC2应该是一个dimer。两个AcrIIC2分离构成一个带负电荷的口袋,这提示AcrIIC2可能和带正电荷的BH domain分离,从而发挥抑止功用。

研讨人员将复合物Nme1Cas9-AcrIIC2用蛋白酶预处置,收到了分辨率高达2.28埃的晶体衍射数据。解出来AcrIIC2 与Nme1Cas B H复合物构造;功用实验进一步考证AcrIIC2和sgRNA竞争性地分离Nme1Cas9 BH 构造域。

王艳丽和Karen Maxwell为论文的共同通讯作者。Karen Maxwell课题组的Annoj Thavalingam、Bianca Garcia,王艳丽课题组的博士生程志、黄雪为论文的共同第一作者。该研讨得到科技部、国度自然科学基金以及中科院的赞助,上海同步辐射光源(SSRF)为该研讨提供了重要的技术支持。

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