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几种蛋白质纯化方法总结
2019-07-08作者:浏览次数:15

别离纯化某一特定蛋白质的普通程序能够分为前处置、粗分级、细分级三步。
1.前处置:别离纯化某种蛋白质,首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并坚持原来的自然状态(假如做不到呢?比方蛋白以包涵体方式存在),不丧失生物活性。为此,动物资料应先提出结缔组织和脂肪组织,种子资料应先去壳以至去种皮以免手单宁等物质的污染,油料种子最好先用低沸点(为什么呢)的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后依据不同的状况,选择恰当的办法,将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处置破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁,普通需求用石英砂或玻璃粉和恰当的提取液一同研磨的办法或用纤维素酶处置也能到达目的。细菌细胞的破碎比拟费事,由于整个细菌细胞壁的骨架实践上是一个借共价键衔接而成的肽聚糖囊状大分子,十分坚韧。破碎细菌细胞壁的常用办法有超声波破碎,与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处置等。组织和细胞破碎后,选择恰当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的办法除去。
假如所要的蛋白主要集中在某一细胞组分,如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等,则可应用差速离心的办法将它们分开,搜集该细胞组分作为下步纯化的资料。假如碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器分离的,则必需应用超声波或去污剂使膜构造解聚,然后用恰当介质提取。
2. 粗分级别离:当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)取得后,选用一套恰当的办法,将所要的蛋白与其他杂蛋白别离开来。普通这一步的别离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级别离等办法。这些办法的特性是烦琐、处置量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大,又不适于用沉淀或盐析法浓缩,则可采用超越滤、凝胶过滤、冷冻真空枯燥或其他办法停止浓缩。
3.细分级别离:样品经粗分级别离以后,普通体积较小,杂蛋白大局部已被除去。进一步纯化,普通运用层析法包括凝胶过滤、离子交流层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法,包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级别离的办法普通范围较小,但分辨率很高。
结晶是蛋白质别离纯化的最后步骤。虽然结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的,但是只要某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才干构成结晶。结晶过程自身也随同着一定水平的纯化,而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白,因而蛋白的结晶不只是纯度的一个标志,也是判定制品处于自然状态的有力指标。
蛋白质别离纯化的办法:
一、依据分子大小不同的纯化办法
1、透析和超越滤
2、密度梯度离心
3、凝胶过滤
二、应用溶解度差异的纯化办法
1、等电点沉淀和pH控制
2、蛋白质的盐析和盐溶
3、有机溶剂分级别离法
4、温度对蛋白质浓度的影响
三、依据电荷不同的纯化办法
1、电泳
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、毛细管电泳
4、等电聚焦
5、层析聚焦
6、离子交流层析
四、应用选择性吸附的纯化办法
1、羟磷石灰层析
2、疏水作用层析
五、应用配体的特异生物学亲和力的纯化办法
亲和层析(affinity chromatography):
a.凝集素亲和层析
b.免疫亲和层析
c.金属螯合层析
d.染料配体层析

e.共价层析

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