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色谱定量分析中内标与外标的纠结如何定
2019-07-02作者:浏览次数:15

色谱剖析的重要作用之一是对样品定量。而色谱法定量的根据是:组分的重量或在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。常见定量剖析办法分为面积归一化法、内标法、外标法、规范曲线法等。大家常常容易傻傻分不分明的莫过于内标法、外标法了。

以内标法为例,选一与欲测组分相近但能完整别离的组分做内标物(当然是样品中没有的组分),然后配制欲测组分和内标物的混合规范溶液,进样得相对校正因子。再将内标物参加欲测组分的样品中,进样后测得欲测组分和内标物的定量参数,用内标法公式计算即可。


其实,从定义上来辨别的话,外标法就是用规范品的峰面积或峰高与其对应的浓度做一条规范曲线,测出样品的峰面积或峰高,在规范曲线上查出其对应的浓度,这是最常用的一种定量办法;内标法是对应外标法说的,内标法是将一定量的纯物质作内标物,参加到精确称量的试样中,依据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比,来计算被测组分的含量。


外标法需求用样品和规范品比照,但是有时我们很难保证样品和规范品进的体积是一样的,毕竟要有误差,这时分就用内标法,就是在外标法的根底上,在样品和规范品里在参加一种物质,经过参加物质的峰面积或峰高的变化,就能够看出我们规范品和样品进样体积的差异,但同时会引进参加物质的秤量误差。所以普通用外标法来定量,假如进样体积很难控制,就用内标法,能够消弭进样体积的误差。


外标法(规范曲线法、直接比拟法)


首先用欲测组分的规范样品绘制规范工作曲线。详细作法是:用规范样品配制成不同浓度的规范系列,在与欲测组分相同的色谱条件下,等体积精确量进样,丈量各峰的峰面积或峰高,用峰面积或峰高对样品浓度绘制规范工作曲线,此规范工作曲线应是经过原点的直线。若规范工作曲线不经过原点,阐明测定办法存在系统误差。规范工作曲线的斜率即为绝对校正因子。

当欲测组分含质变化不大,并已知这一组分的大约含量时,也能够不用绘制规范工作曲线,而用单点校正法,即直接比拟法定量。单点校正法实践上是应用原点作为规范工作曲线上的另一个点。因而,当办法存在系统误差时(即规范工作曲线不经过原点),单点校正法的误差较大。因而规则,y=ax+b b的绝对值应不大于100%响应值是y的2%。
规范曲线法的优点:绘制好规范工作曲线后测定工作就很简单了,计算时可直接从规范工作曲线上读出含量,这对大量样品剖析非常适宜。特别是规范工作曲线绘制后能够运用一段时间,在此段时间内可经常用一个规范样品对规范工作曲线停止单点校正,以肯定该规范工作曲线能否还可运用。
内标法的关键是选择适宜的内标物。内标物应是原样品中不存在的纯物质,该物质的性质应尽可能与欲测组分相近,不与被测样品起化学反响,同时要能完整溶于被测样品中。内标物的峰应尽可能接近欲测组分的峰,或位于几个欲测组分的峰中间,但必需与样品中的一切峰不堆叠,即完整分开。
内标法的优点:进样量的变化,色谱条件的微小变化对内标法定量结果的影响不大,特别是在样品前处置(如浓缩、萃取,衍生化等)前参加内标物,然后再停止前处置时,可局部补偿欲测组分在样品前处置时的损失。若要取得很高精度的结果时,能够参加数种内标物,以进步定量剖析的精度。
规范参加法的优点:不需求另外的规范物质作内标物,只需欲测组分的纯物质,进样量不用非常精确,操作简单。若在样品的前处置之前就参加已知精确量的欲测组分,则能够完整补偿欲测组分在前处置过程中的损失,是色谱剖析中较常用的定量剖析办法。
1.内标物应是该试样中不存在的纯物质;
2.它必需完整溶于试样中,并与试样中各组分的色谱峰能完整别离;
3.参加内标物的量应接近于被测组分;
4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近,或在几个被测组分色谱峰中间。
内标法的优点是测定的结果较为精确,由于经过丈量内标物及被测组分的峰面积的相对值来停止计算的,因此在一定水平上消弭了操作条件等的变化所惹起的误差。内标法的缺陷是操作程序较为费事,每次剖析时内标物和试样都要精确称量,有时寻觅适宜的内标物也有艰难。
外标法烦琐,但进样量请求非常精确,要严厉控制在与规范物相同的操作条件下停止,否则形成剖析误差,得不到精确的丈量结果。

规范曲线法的缺陷:每次样品剖析的色谱条件(检测器的响应性能,柱温度,活动相流速及组成,进样量,柱效等)很难完整相同,因而容易呈现较大误差。另外,规范工作曲线绘制时,普通运用欲测组分的规范样品(或已知精确含量的样品),因而对样品前处置过程中欲测组分的变化无法停止补偿。


内标法


选择适合的物质作为欲测组分的参比物,定量加到样品中去,根据欲测组分和参比物在检测器上的响应值(峰面积或峰高)之比和参比物参加的量停止定量剖析的办法称为内标法。

内标法的缺陷:选择适宜的内标物比拟艰难,内标物的称量要精确,操作较费事。运用内标法定量时要丈量欲测组分和内标物的两个峰的峰面积(或峰高),依据误差叠加原理,内标法定量的误差中,由于峰面积丈量惹起的误差是规范曲线法定量的2-2是由于进样量的变化和色谱条件变化惹起的误差,内标法比规范曲线法要小很多,所以总的来说,内标法定量比规范曲线法定量的精确度和精细度都要好。


规范参加法


规范参加法本质上是一种特殊的内标法,是在选择不到适宜的内标物时,以欲测组分的纯物质为内标物,参加到待测样品中,然后在相同的色谱条件下,测定参加欲测组分纯物质前后欲测组分的峰面积(或峰高),从而计算欲测组分在样品中的含量的办法。

规范参加法的缺陷:请求参加欲测组分前后两次色谱测定的色谱条件完整相同,以保证两次测定时的校正因子完整相等,否则将惹起剖析测定的误差。


选择内标物有4个请求:

内标与外标都是定量的一种办法而已,至于哪一种办法好与不好不能混为一谈,做不同的剖析,面对着不同的请求,再加上剖析本钱剖析效率等等问题,我想简单而有效停止定量剖析来满足请求才是最重要的。


下面用几个例子来阐明:


1、以前做过很多医药、农药中间体的芳香族卤代化合物的常量定量剖析,没有自动进样器,用外标法定量,的确重现性与稳定性十分差,结果经常遭到搞合成同事的质疑。其实,认真剖析缘由不一定就是外标法不合适这种定量剖析,首先我们的实验室仪器和手腕能否调整到一种稳定而合理的状态了,比方,衬管能否干净,玻璃棉的位置能否适宜恰当(能否使样品尽可能的汽化)、汽化温度能否适宜、色谱峰形能否对称(也就是样品与色谱柱健合相能否匹配)、左近有没有其它色谱峰的干扰、选用什么进样方式(如快速进样还是热针进样)等等要素的影响都需求思索,假如这些要素都思索了,依照GMP办法考证关于精细度的请求,同一样品进6针以上的RSD和配制6个样品的定量结果RSD都能满足小于1.5%的请求,那么这个办法用外标法就是完整适用的,但是前面的影响要素是一定要都思索到的,否则议论这个办法能否适用就有失偏颇了。在做过的许多出口产品的定量剖析办法当中有许多是一些医药公司提供的比拟完善而考证过的办法,内标与外标都有(他们用的都是自动进样)精细度都能满足RSD小于1.5%的请求,当一个办法可以满足测试请求的时分,无论内标外标,都是可行的,当然有一个剖析本钱和剖析时间的问题,内标的本钱和控制溶液、样品溶液的配制当然要比外标要高和费事一些了。而有些时分,可能受你实验室现有仪器和隶属设备的影响,达不到一定的请求,而还必需停止定量剖析,有时外标的结果可能就要差一些,这时,你可能就要思索用内标法了,能够扫除手动进样的误差、分流歧视的影响、包括一些未知要素平行误差的影响,这时内标可能就显现出它的优势来了。


2、上面曾经提到当做办法考证的时分,当同一样品配制6个样品溶液用所选用的外标法停止定量的时分,RSD都满足1.5%的请求时,也分为两种状况,小于1%和大于1%小于1.5%。假如RSD的结果小于1%,那这个办法就没有什么能够疑心的了;假如RSD的结果大于1%而在1.5%略低一些的范围活动时,这个办法的可行性就将遭到质疑,毕竟这是办法考证,你就要思索上面1所提到的影响要素的影响了,假如扫除掉以上的影响要素,RSD还是在1.5%左近,就要尝试内标了,假如内标结果的RSD很好,就证明你的这个办法受实验条件的影响很大,只能用内标了,或者痛快将原办法做大的变动,再尝试用外标法测试。


3、而关于微量剖析,比方农药和兽药残留的剖析、环境剖析等,依据不同的限量规范请求关于精细度的请求也比常量剖析的请求要宽松的多,RSD有时能够允许到达10%以至更高,这时可能外标法有更大的应用空间。


4、单从精细度方面去思索,扫除其它本钱和效率的要素,个人以为还是内标优于外标。曾经做过一个中间体二氨基丙醇的常量定量剖析,以二乙醇胺为内标,RTX-5amine(碱改性)15m*0.32mm*1.0um色谱柱剖析,将配制好的控制溶液(含有内标物)自动进样器进6针,目的物(二氨基丙醇)与内标物(二乙醇胺)峰面积比率的RSD为0.18%,而只对这六针样品的目的物峰(二氨基丙醇)面积求RSD,结果为0.71%,经过这一实例的结果大家就会发现到底哪个办法精细度更好了,当然是内标更好了。当然这个化合物的检测办法最后依据上面的考证数据用内标和外标定量都是能够的,实验室能够自在选择。但内标与外标精细度结果的差别是显然存在的事实。


小结


综上所述,假如应用外标法可以满足请求的话,当然首选还是外标法,毕竟简单而省事。关于精细度请求比拟高、结果精确度会产生严重影响、实验室条件不是很理想的等等条件下,用内标法还是必要的。但无论应用那种办法,办法的考证和确认都是很重要的,只需是依照程序经过考证和确认的办法,都有其应用的空间的。个人观念,供大家参考。

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