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质粒抽提的基本原理及操作流程
2019-09-11作者:浏览次数:5

质粒抽提的基本原理及操作流程

⒈质粒抽提基本原理

在其中采用几种水溶液及其硅酸化学纤维膜(超滤膜柱)。 水溶液Ⅰ:50 mM果糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA,pH 8.0;水溶液Ⅱ:0.2 N NaOH / 1%SDS; 水溶液Ⅲ:3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%乙醇。
水溶液Ⅰ
果糖是使飘浮后的大肠埃希菌不容易迅速堆积到水管的底端;EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属材料正离子的螯合剂,其关键目地是以便鳌合二价金属材料正离子进而达到抑制DNase的特异性;可加上RNase A消化吸收RNA。
水溶液Ⅱ
此步为碱解决。在其中NaOH关键是以便融解体细胞,释放出来DNA,由于在强偏碱的状况下,细胞质产生了从两层膜结构工程向微囊构造的转变。SDS与NaOH联用,其目地是以便提高NaOH的强偏碱,一起SDS做为阳离子表活剂毁坏脂两层膜。那步要记牢二点:首位,時间不可以太长,由于在那样的偏碱标准下基因组DNA片段也会渐渐地破裂;其次,务必溫柔混和,要不然基因组DNA会破裂。
水溶液Ⅲ
水溶液III的功效是沉定蛋白质和中和反应。在其中醋酸钾是以便使钾离子换置SDS中的钾离子而产生了PDS,由于十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)碰到钾离子后变为了十二烷基硫酸钾 (potassium dodecylsulfate, PDS),而PDS不是溶水的,一起1个SDS分子结构均值融合2个碳水化合物,钾钠正离子换置所造成的很多沉定大自然就将绝大多数蛋白沉定了。2 M的醋酸是以便中合NaOH。基因组DNA如果产生破裂,要是是50-100 kb尺寸的片段,就沒有方法再被 PDS共沉淀了,因此碱解决的時间要短,并且不可猛烈震荡,要不然最终获得的质粒上都会有很多的基因组DNA渗入,琼脂糖电泳能够 观查到这条浓浓总DNA条带。75%乙醇关键是以便清理盐分和抑止Dnase;一起水溶液III的强酸碱性都是以便使DNA尽快融合在硅酸化学纤维膜上

⒉质粒抽提流程
⑴应用质粒提取试剂盒获取质粒时请参照实际试剂盒的操作指南。如Omega企业的E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I, Q(capless) Spin (质粒提取盒)。
⑵碱裂解手提式法:此方式适用少量质粒DNA的获取,获取的质粒DNA可立即用以酶切、PCR测序、银染编码序列分析。方式给出:
①接1%含质粒的大肠埃希菌体细胞于2mlLB培养液。
②37℃震荡塑造留宿。
③取1.5ml菌体于Ep管(离心管),以4000rpm抽滤3min,弃上清液。
④加0.lml水溶液I(1%果糖,50mM/LEDTApH8.0,25mM/LTris-HClpH8.0)充足混和。
⑤添加0.2ml水溶液II(0.2mM/LNaOH,1%SDS),轻轻地旋转搅拌,放置冰浴5min.
⑥添加0.15m1预冷水溶液III(5mol/LKAc,pH4.8),轻轻地旋转搅拌,放置冰浴5min.
⑦以10,000rpm抽滤20min,取上清液于另翻新Ep管。
⑧添加等容积的异戊醇,搅拌后静放10min.
⑨以10,000rpm抽滤20min,弃上清。
⑩用70%酒精0.5ml清洗一回,吸干全部液體。
⑪待沉定干躁后,溶解50ulTE缓冲液中(或60℃温育双蒸水)。

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